制备DNB
取出0.2 mL八联管或PCR管，按照下表配制时空DNB制备反应混合液1：
时空DNB制备反应混合液1 组分
管盖颜色
体积（μL）
90 μL体系
45 μL体系
TE缓冲液
20-V
10-V
时空组学DNB制备缓冲液
20
10
dsDNA文库
/
V
V
总体积（μL）
40
20
将时空DNB制备反应混合液1用涡旋振荡器振荡混匀，迷你离心机离心5 s，置于PCR仪中进行引物杂交，反应条件见下表：
DNB制备引物杂交反应条件 温度
时间
105 ℃（热盖）
On
95 ℃
3 min
程序反应结束后立即将样本置于冰上，放置2 min
取出DNB聚合酶混合液Ⅱ（OS-V4.0），短暂离心5 s，置于冰上备用。
注意：DNB聚合酶混合液Ⅱ（OS-V4.0）需在冰上操作，勿置于室温。使用时需握住试剂管顶部，勿触碰管壁。手掌温度或室温可能会影响酶的活性。
装有时空DNB制备反应混合液1的PCR管冷却后，使用迷你离心机离心5 s，在冰上将下表列出的试剂加入管中，制备时空DNB制备反应混合液2：
时空DNB制备反应混合液2 组分
管盖颜色
体积（μL）
90 μL体系
45 μL体系
DNB聚合酶混合液Ⅰ（OS-V4.0）
40
20
DNB聚合酶混合液Ⅱ（OS-V4.0）
2
1
总体积（μL）
42
21
用涡旋振荡器振荡混匀，迷你离心机离心5 s，即刻置于PCR仪中，反应条件如下：
温馨提示：部分品牌的PCR仪的热盖升降温速度慢。在热盖升降温过程中，加热模块处于室温状态，且程序未运行。对于这种类型的PCR仪，需提前进行热盖预热，确保在进行DNB反应时热盖处于工作温度。
热盖温度建议设置为35 ℃，或尽可能设置成接近35 ℃的最低温度。
DNB制备滚环扩增条件 温度
时间
35 ℃ （热盖）
On
30 ℃
20 min
4 ℃
Hold
当PCR仪温度达到4 ℃后立即取出PCR管置于冰上，加入5 μL DNB终止缓冲液（45 μL体系） 或10 μL DNB终止缓冲液（90 μL体系），用无滤芯的阔口吸头缓慢吹打混匀8次。完成后立即测定DNB浓度，并尽快上机测序。
注意：操作过程中，务必将DNB置于冰上。
务必使用阔口吸头（不带滤芯）缓慢吹打混匀DNB。切勿离心、振荡及剧烈吹打。
制备完成的DNB需置于2 ℃~8 ℃。