制备DNB
取出0.2 mL八联管或PCR管，根据不同文库类型制备相应的DNB制备反应混合液1或App DNB制备反应混合液1。
T7+ FCL PE100或T7+ FCL PE150型号的插件试剂盒1中的DNB制备试剂适用于MGI文库：
DNB制备反应混合液1 组分
管盖颜色
体积（μL）
90 μL体系
45 μL体系
TE缓冲液
20-V
10-V
DNB制备缓冲液
20
10
ssDNA文库
/
V
V
总体积（μL）
40
20
T7+ App-D FCL PE100或T7+ App-D FCL PE150型号的的插件试剂盒1中的DNB制备试剂适用于App文库（TruSeq和Nextera接头）和MGI文库：
App DNB制备反应混合液1 组分
管盖颜色
体积（μL）
90 μL体系
45 μL体系
TE缓冲液
20-V
10-V
App DNB制备缓冲液
20
10
ssDNA文库
/
V
V
总体积（μL）
40
20
将DNB制备反应混合液1或App DNB制备反应混合液1用涡旋振荡器振荡混匀，迷你离心机离心5 s，置于PCR仪中进行引物杂交，反应条件见下表：
DNB制备引物杂交反应条件 温度
时间
105 ℃（热盖）
On
95 ℃
1 min
65 ℃
1 min
40 ℃
1 min
4 ℃
Hold
取出DNB聚合酶混合液Ⅱ（LC），短暂离心5 s，置于冰上备用。
注意：DNB聚合酶混合液Ⅱ（LC）需在冰上操作，勿置于室温。勿振荡混匀。使用时需握住试剂管顶部，勿触碰管壁。手掌温度或室温可能会影响酶的活性。
当PCR仪达到4 ℃后取出PCR管，迷你离心机离心5 s后，置于冰上。
在冰上将下表列出的试剂加入装有DNB制备反应混合液1或App DNB制备反应混合液1的PCR管中：
DNB制备反应混合液2 组分
管盖颜色
体积（μL）
90 μL体系
45 μL体系
DNB高效聚合酶混合液Ⅰ
40
20
DNB聚合酶混合液Ⅱ（LC）
1.6
0.8
总体积（μL）
41.6
20.8
用涡旋振荡器振荡混匀，迷你离心机离心5 s，即刻置于PCR仪中，反应条件如下：
DNB制备滚环扩增条件 温度
时间
35 ℃ （热盖）
On
30 ℃
10 min
4 ℃
Hold
温馨提示：部分品牌的PCR仪的热盖升降温速度慢。在热盖升降温过程中，加热模块处于室温状态，且程序未运行。对于这种类型的PCR仪，需提前进行热盖预热，确保在进行DNB反应时热盖处于工作温度。
热盖温度建议设置为35 ℃，或尽可能设置成接近35 ℃的最低温度。
当PCR仪温度达到4 ℃后立即取出PCR管置于冰上，加入5 μL DNB终止缓冲液（45 μL体系）或10 μL DNB终止缓冲液（90 μL体系），用无滤芯的阔口吸头缓慢吹打混匀8次。完成后立即测定DNB浓度，并尽快上机测序。
注意：操作过程中，务必将DNB置于冰上。
务必使用阔口吸头（不带滤芯）缓慢吹打混匀DNB。切勿离心、振荡及剧烈吹打。
制备完成的DNB需置于2 ℃~8 ℃。